DNA身份鉴定 解密品种“黑匣子” |
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《 农民日报 》（ 2015年06月01日 06 版） 编者按针对目前我国农作物品种身份鉴定手段落后、套牌侵权、珍贵种质资源流失等问题，农业部办公厅于近日印发了《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》，将在已有种质资源库基础上，构建全国统一的品种DNA信息数据库及品种身份查询平台，实现品种身份可鉴定、信息可查询、资源可保护、材料可流通、成果可交易、种子可追溯。品种管理的DNA鉴定模式由此开启。 |
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链接 第一，全基因组测序并不适合直接用于品种鉴定中。品种鉴定主要是寻找样品间差异的过程，在全基因组水平上，品种间甚至物种间绝大部分碱基序列是相同的，如人类与灵长类全基因组序列98%以上核苷酸相同，DNA序列中无差异的部分对于品种区分没有实际意义。 第二，基因组测序，仅针对某个基因组如叶绿体基因组、线粒体基因组以及外显子区测序等方法也不适合用于品种鉴定中。 第三，基于第二代测序技术进行SNP基因分型方法，或者利用Nimblegen序列捕获芯片技术，设计探针捕获到目的SNP区域片段，在基于测序技术检测基因型。随着测序技术的发展和成本的降低，机遇测序技术检测SNP的方法具有一定发展潜力。 DNA指纹鉴定技术的发展历程？ 随着现代生物技术发展，品种鉴定技术从形态鉴定进入到DNA指纹技术水平。品种指纹鉴定技术发展经历了3个重要阶段：20世纪90年代的第一代标记技术RELP（限制性片段长度多态性）和PARD（随机扩增多态性），21世纪初兴起的第二代标记技术SSR（简单重复序列），近几年启动研究的第三代标记技术SNP（单核苷酸多态）。其中，SSR和SNP被UPOV的BMT分子测试指南推荐作为品种鉴定和数据库构建的优选标记。 采用不同器官组织提取DNA对品种鉴定有无影响？ DNA指纹技术通过鉴别不同品种间遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序不同，从而区分不同品种。对于一个玉米品种而言，从其种子、幼苗、叶片、苞叶中提取的DNA代表了该品种的基因组序列特征，对DNA指纹鉴定的结果准确性不会产生任何影响；但从杂交种种子果皮上提取的DNA和从杂交制种天母本植株所结的果穗籽粒提取的DNA并不能代表该品种的基因组序列特征，会严重影响该品种的DNA指纹鉴定结果准确性。 品种分子监测与转基因检测有何异同？ 相同之处是应用的技术手段基本相同。 不同之处，一是品种真实性及纯度鉴定的分子检测是对品种的整体遗传背景的监测，具体选用的引物位点因所鉴定的物种不同而不同；转基因检测是对目的基因的监测，具体引物位点的选择因所鉴定的基因而不同，与物种无关。二是两种检测项目在实验污染控制方面是不同的，造成污染的原因也不同。种子真实性和纯度检测污染主要出现在样品准备阶段，环境中的外源核酸一般不会对其检测结果产生影响；而转基因检测主要污染出现在PCR扩增阶段，环境中的外源核算容易导致检测结果出现假阳性。 ——摘编自中国农业科学技术出版社《玉米品种DNA指纹鉴定技术100问》 |
给种子做个“亲子鉴定” ●DUS田间表型鉴定是对申请保护的植物新品种进行特异性、一致性和稳定性的栽培鉴定试验或室内分析测试的过程。测试方法是将申请品种与近似品种在相同的生长条件下，从植物的种子、幼苗、开花期、成熟期等各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等作出观察记载，并与近似品种进行结果比较。 ●DNA室内基因型鉴定是一项生物学检测技术，以玉米为例，玉米有总数约为30亿个碱基对的DNA，每个品种的DNA都不完全相同，品种与品种之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也有差异，由此可以识别不同的品种。 本报记者缪翼李国龙 如果将100个品种撕掉标签和包装，通过种子形态或者田间种植进行形态观察让它们一一对号入座，辨别出分别是什么品种，我想几乎没有人能够做到，那成千上万个品种就更不可能做到了。但利用DNA指纹技术识别这些品种就轻而易举了，一天就可以完成。“这就是DNA鉴定技术既准确可靠，又经济快捷的优势。”北京市农林科学院玉米研究中心主任赵久然的信心来自于他们团队20余年持之以恒的关于玉米标准DNA技术的研究与应用。 农业部办公厅日前发布了《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》，明确了农作物品种DNA身份鉴定体系构建的重要意义和发展方向。 且说快和准 难以想象仅2014年一年时间里，玉米中心做过的DNA指纹检测鉴定样本量达1万多份。“正常程序是7个工作日之内出结果，加急样品48小时内出结果。”检测中心王凤格博士说，“无论是已审定的、参加过区试的，还是提交品种权保护的品种，凡是在玉米中心做过检测的，其‘指纹’和痕迹就会永久留存了。目前，这个标准指数库已经保存了2万多个玉米标准DNA指纹信息，未来还会进一步扩容。” 人类DNA鉴定技术的应用也有近20年了，通过人的DNA检测可以进行亲子鉴定，更可以用于刑事侦查中的DNA比对，已经成为公安机关有效的破案利器。作物与人都属于生物，遗传信息载体都是DNA，很多技术是相通的，但也有不同之处。赵久然解释，在人类DNA检测结果判别上，引入最大似然率概念，就是说两个样本的DNA鉴定结果完全一样，也存在着极小概率不是同一个人的可能性。而在玉米品种判定中，没有使用“最大似然率”这个概念，采用了“高度近似”这个概念。就是说如果两个品种的DNA鉴定结果相同，其判定结论是“相同或高度近似”，有可能不同，但即使有些许差异，这种差异也是很小的，顶多属于派生品种范畴。如果把两个品种种在一起，连育种者自己都分不清哪个是他育成的品种，还能说那是一个新品种吗？“同”是相对的，“不同”是绝对的，没有两个绝对相同完全一样的事物，关键是确定和把握好尺度。 |
遏制“仿冒套” 有人说“市场上至少1/3的种子是假冒的。”有人感慨“新品种培育六七年，仿冒才几天。”业内认为“仿冒套”伤的是种业创新力，呼吁通过DNA身份鉴定这项技术支撑，能够对“仿冒套”起到遏制作用，鼓励真正的品种创新，引导市场走向自律。 人靠相貌等可以辨别，而DNA鉴定是最终途径。农作物也是一样，由于少数具备高产、广适、抗病等特性的亲本被集中应用，在原品种基础上稍作修改的派生品种越来越多，品种间的遗传差异是肉眼所难以辨别的，这时就需要DNA来鉴定其身份了。 例如山东济南中院受理先锋公司告某公司生产的“费玉3号”侵犯“先玉335”品种权案，经玉米中心DNA检测，“费玉3号”与农业部“先玉335”标准样品比较，在40个位点上位点差异为1，被告未提出有利证据证明不是同一品种，判决被告停止侵权并赔偿原告经济损失。 “依据玉米DNA指纹检测标准，如果差异位点数≥2，证明为不同品种；差异位点数≤1，则证明品种相同或高度近似。”赵久然说，“这其中是留有框量的，但是基本不给‘仿冒套’钻空子的余地。” 不是随便“抓一把” 玉米有30亿个碱基对，凭什么仅靠目前的40个位点检测结果，就能判断清楚？ 对此，赵久然说，这40个位点不是随便“抓一把”。2001年起确立了核心引物组合法的品种鉴定方案，从2001年~2005年，经过4年多系统筛选和重新设计，形成了一套共40个位点适于玉米品种鉴定的SSR（简单重复序列）引物组合，这些位点都存在等位基因，在不同品种间存在着明确的差异，这些差异组合就可以组合出巨大的天文数字。在此基础上研制出国内首个和唯一的适合玉米品种真实性检测的的DNA指纹复合扩增试剂盒专利产品。利用这套引物，仅玉米中心就开展了近5万份样品的真实性检测，充分检验了40个引物的有效性。 SNP（单核苷酸多态性）技术是否就此取代了SSR技术在DNA身份鉴定测试中的应用？ “实际上是推广一代，研究一代。”赵久然说，每种标记技术都在特定时期内对品种检测工作发挥一定作用，其中SSR和SNP由于均为共显性遗传、染色体定位清楚、具有高通量自动化的潜力而被UPOV的BMT分子测试指南推荐作为品种鉴定和数据库构建的优选标记。赵久然认为，两种标记技术均是比较适合品种指纹分析的标记，其中SSR标记可以满足大部分样品快速低成本的进行真实性检测的要求，而SNP标记可以对其中鉴别困难的派生品种进行精细鉴别，两种标记技术各自具备优缺点，可优势互补，未来将长期并存应用。 |
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卢洪 国务院2011年8号文件把种业定义为国家基础性、战略性核心产业，种业安全是我国粮食安全的重要保障。为了进一步激发种业科技创新活力，创建公平竞争的市场环境，加强种质资源保护、品种权保护与管理，按照《国务院办公厅关于深化种业体制改革提高创新能力的意见》的要求，急需构建适应现代需求的以玉米为代表的农作物品种DNA身份鉴定体系。 同时，随着现代分子生物学的不断进步，尤其是近年来基因组学的发展，使利用基因组学的研究成果进行玉米品种管理和种子质量检验已经成为可能。另外，移动互联、大数据引发的产业变革，为品种管理向田间表型身份鉴定与室内基因型身份鉴定相结合的方向发展提供了有力的技术支撑。现代种业的发展对品种管理的数字化、便捷化、智能化提出了更高的要求，可以看出，构建以玉米为代表的主要农作物品种DNA身份鉴定体系构建具有非常重要的意义。 近20年来，以基因组学，高通量DNA测序技术和生物信息学为代表的现代生物技术科学获得了突飞猛进的发展，这些技术为建设以SNP检测为基础的新一代DNA身份鉴定体系打下了坚实的基础。因此，建设新一代玉米DNA身份鉴定体系从技术上已经完全成熟。 具体来讲，新一代玉米DNA身份鉴定体系主要包括针对3种不同类型资源-品种身份鉴定、育种材料确权、种质资源评价分别建立SNP鉴定标准。具体工作包括： 筛选适用于品种身份鉴定、育种材料确权、种质资源评价的不同检测目的的SNP位点组合。根据解决品种身份鉴定、育种材料确权、种质资源评价3类不同鉴定内容，分别制定SNP位点筛选原则、位点数目、位点组合等。 制定玉米品种SNP身份鉴定、育种材料确权、种质资源评价的检测技术规范。借鉴国际做法，依托SNP技术，在DNA样品制备、检测平台选择、结果表述、判定阈值等问题分别进行研究，制定适用于玉米品种身份鉴定、育种材料确权、种质资源评价3类不同目的的SNP分子标记检测技术规范。 玉米品种DNA身份鉴定体系技术验证。由全国农技中心、农业部科技发展中心分别组织相关检测机构、DUS测试中心等单位对玉米DNA身份鉴定位点组合和技术规范进行多实验室间验证。技术验证方案：制定和分发统一的技术操作规范、结果报告格式和验证样品，在不同实验室之间对利用相同位点组合构建SNP指纹数据的一致性验证，对品种鉴定结果的一致性验证。由项目主持单位汇总提交验证总结报告，全国农技中心、科技发展中心对提交的报告进行比对、分析及验收。 建立玉米品种DNA身份信息数据库及品种身份查询平台。依据制定的技术规范，建立玉米品种DNA身份信息数据库包括育成品种、育种材料、种质资源三大类样品的DNA身份信息。玉米DNA指纹数据库构建需重点研究确定指纹质量保证和数据库管理使用问题，同时解决不同分子标记技术、不同检测技术（芯片技术、测序技术、荧光扫描技术、电泳技术等）数据采集、数据结构格式不同的问题，实现数据可整合共享。 （作者系中玉金标记北京生物技术股份有限公司总裁） |
SNP检测可实现全程自动化 张健 国以农为本，农以种为先。培育和生产优良的种子是种业的核心任务，而我国目前的种业市场存在品种间同质化严重、套牌侵权泛滥、种子质量良莠不齐等问题，育种单位间的种质资源难以正常流动，但育种材料流失依然严重，这些问题严重制约着我国现代种业的发展。解决这些问题的根本在于对种质资源、育种材料和作物品种进行有效保护，从DNA水平上对农作物品种和材料进行鉴定是实施品种保护的基础。 目前，SNP检测作为最新的分子标记检测方法，已被众多国际组织，如国际种子检验协会（ISTA）、国际植物新品种保护联盟（UPOV）、国际种子联盟（ISF）等，推荐为DNA水平上品种鉴定的方法。杜邦先锋、孟山都和先正达等国际一流农业公司也都采用了SNP标记对内部的育种材料和不同品种进行分类鉴定。农业部最近印发的《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》也标志着我国DNA水平上的品种鉴定将实施采用SNP技术。 我们知道，不同人在基因水平上是有很大差异的。同样，同一作物的不同品种在DNA水平上也有很多差异，SNP是由单个核苷酸（A,T,C,G）的改变而引起的DNA序列的变化。例如在一个品种中某一位点上的核苷酸是A，但在另一品种中则变成了T，这种单核苷酸水平上的变化可以稳定遗传，并能通过一定手段被准确检测。品种之间也有不少位点存在着这样的稳定差异，通过比较不同的SNP位点就可有效区分不同的品种和育种材料。 目前常用的SNP检测方法有3种： 高通量SNP检测。用PCR的方法特异扩增目标位点，在反应体系中加上能区分SNP型的荧光引物或探针，反应完成后通过检测荧光信号就可以判断该SNP位点上核苷酸类型。这种检测方法已经非常成熟，全程可使用自动化技术，检测过程无需人为干预，因而具有成本低、可重复性高、快速准确可靠等特点，非常适合对大量样本的SNP检测。华智水稻生物技术有限公司引进的LGCSNPLine系统和道格拉斯的ArrayTape系统即属于该类，可迅速检测几百到几万份样本中的SNP位点。 SNP芯片技术。将大量的SNP探针固定在一张芯片上，将品种样本DNA与芯片杂交，通过采集芯片上的荧光信号，可一次检测该品种中成千上万个SNP位点。目前市面上已有Affymetrix和Illumina公司提供SNP芯片和相应设备。比较而言，SNP芯片技术检测一个样本的成本较高。 测序检测。该方法通过对全基因组或目标位点扩增后进行测序，直接读取相关位点的核苷酸碱基类型，从而可检测出不同品种间的SNP位点差异。该方法能产生大量的序列数据，可能发现一些未知的DNA变异，但需要专业的生物信息分析，目前成本相对比较高，技术的成熟度也不如前两种。 高通量SNP检测方法对DNA样本的质量要求不高，可使用全自动设备提取的DNA样本，操作简捷快速。SNP检测过程全程自动化操作，无需开盖操作，不仅结果准确，重复性高，还能降低人工和试剂的成本，其功能类似于识别品种身份的“读卡器”。 （作者系华智水稻生物技术有限公司总经理） |
