种子纯度检验方法及种子纯度检测技术进展

 

      近几年来，随着生化分析和分子生物学技术的迅速发展，农作物种子纯度检验方法已由外观形态发展到生理生化水平和分子水平上的鉴正。

 

      一、形态检验法

 

      形态学方法是检验人员借助放大镜、解剖镜等工具，依据某一作物品种不同于其他品种的特定的外观形态特征来进行鉴定的方法。

 

      1.种子形态检验法根据种子形状、大小、色泽、质地、表面的光与毛以及种子外表各部位的特征来加以鉴别，以区分本品种与异品种。该法简单、经济、快速，但准确性较差，且随着现代育种科学的发展，不同品种间种子外观形态的差异越来越小，因此靠区别种子形态上的差异来鉴定种子纯度也变得越来越困难。

 

      2.种苗形态检验法该法根据不同品种幼苗的独特性状进行检验，如幼苗芽鞘颜色、幼苗生长锥、于叶的形状、颜色、大小等。该法简便、省时，但受环境的影响颇大，检验结果不够可靠。

 

      3.田间小区种植检验法(成株期形态检验法)该法是将一定量的作物种子在田间种植一个小区，单粒播种，不间苗，不定苗，并设有标准品种小区作对照，成株期依据其主要特征鉴定纯度，这是最为通用的且比较可靠的方法。主要根据株形、株高、叶片数、叶色、叶片宽窄、花药颜色等作出评判。但此法所需时间较长，当年所生产的种子要等下一个生长季节或异地鉴定才能得到结果，往往丧失商机，且费工占地。而且这种方法受环境影响颇大，使得鉴定结果的准确性受到一定程度的影响。由于形态学方法的诸多不足，用一种快速、简便、准确、实用的室内检测方法来代替形态法已成必然。将电泳技术和DNA分子标记技术应用到纯度鉴定这一领域，恰恰顺应了这一要求。

 

      二、蛋白质电泳技术检验法

 

      蛋白质电泳技术检验法是指利用电泳技术对备检样品的种子或幼苗的蛋白质进行分离、染色，形成蛋白质电泳谱带的差异，并与标准品种相比较，从而鉴定品种的真实性和纯度的一种方法。不同作物品种，基因不同，基因的直接表达产物——蛋白质在种类、数量、结构等方面亦不同。该法即是利用蛋白质的多态性来反映不同品种DNA组成上的差异，从而进行品种鉴定。该法快速、可靠，不受环境影响。

 

      1.同工酶电泳法同工酶是指来源相同，催化相同反应而结构不同的酶分子类型，具组织、发育和品种间特异性。该法是指利用电泳技术(包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳等)来分离各种酶的同工酶，通过比较同工酶诺，来确定作物种子的纯度。

 

      目前，在作物种子纯度鉴定中，最常用的、多态性较强的是脂酶和过氧化物酶，所用方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳法。Quillet等(1992)研究了地理起源不同的52个向日葵自交系的8个同工酶系统，表明同时运用8种同工酶系统可鉴定出其中45个基因型，占总基因型的84%。但与其他方法相比，该法还存在着一些不足：

 

      ①同工酶具组织、发育的特异性：不同组织、不同发育时期，同工酶的数量和组成不同。利用同工酶鉴定种子纯度所用材料多为幼苗，而将种子萌发为幼苗不光费时，还往往因为种子在萌发进程上的不一致而导致检验结果偏差较大;②谱带位点与凝胶浓度、提取液配方、电泳程序等有关;因酶易失活，故技术上有一定难度。

 

      2.种子贮藏蛋白电泳法种子中所含的贮藏蛋白质可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一类蛋白质的比例因物种而异，但在品种鉴定上多是根据醇溶蛋白(禾谷类)和球蛋白(豆类)的多样性。

 

      不同蛋白质所带电荷不同，在电场中泳动的速度也不同，电泳之后，通过染色显示蛋白质条带的数目、位置和颜色深浅，便构成品种的“指纹”特征，可用于品种鉴定。

 

      所用电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉胶电泳及等电聚焦电泳等。E11Zs等(1997)利用淀粉凝胶电泳分析了29个英国小麦品种的醇溶蛋白，除极个别外，这些品种都能被区分开。但值得注意的是，对于某些遗传组成非常接近的品种，如保持系和不育系，不易找到特异蛋白，采用蛋白质电泳难以发现特征带。另外，蛋白质电泳图谱易受种子(或幼苗)发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了图谱分析，从而影响了鉴定结果的准确性。

 

      目前，国外许多先进种子检验实验室多采用超薄等电聚焦电泳法来进行品种鉴定。该法操作方便、准确性高、制胶速度快。由于凝胶超薄(0.15mm)，因而可降低检验成本，且缩短了固定、染色和脱色时间。再加上该法采用水平平板电泳槽，可进行双聚焦，这样就大大增加了点样数量，从而提高了工作效率。

 

      三、DNA分子标记技术检验法

 

      品种间形态和生化上的区别.归根到底是 1DR种间在基因(DNA)上的区别。DNA分子标记技术即是通过对品种DNA的多态性即DNA减基序列的差异进行分析，从而鉴别不同品种。其检测对象是种子的DNA片段(基因)，没有器官的特异性，不受环境的影响，有较高的准确性、稳定性和重复性。目前，在作物品种鉴定中应用的有RFLP技术、RAPD技术、微卫星技术和AFLP技术等。

 

      1.RFLP技术 RFLP(Restriction Frag— nent Len Polymorphism)是由GrOdztcker〔1974)最早创立的，是分析不同生物个体间基因细微差异的可靠方法。

 

      它的基本原理是：当用限制性内切酶切割不同品种的DNA时，会产生相当多的数目和大小不等的DNA片段。对其进行电泳，并利用放射性同位素标记的DNA作探针进行分子杂交，来显示与探针同源的酶切片段在长度上的多态性，从而将不同1bn种的种子区别开来。

 

      由于同种作物不同品种间能找到较多RFLP标记，利用某一品种特定的RFLP可以准确地标记该品种，因而该项技术是进行品种真实性及纯度鉴定的可靠方法。RFLP多态性稳定、容易重复，结果准确。但该技术也存在一些不足之处：多态有限、成本昂贵、费时，同时放射性同位素的使用会影响人体安全，从而限制了该技术在实践中的应用。

 

      2.RAPD技术 RAPD(Randomly AmPli— ied Polymorphic DNA)是由美国杜邦公司Williams等人(1990)和加利福尼亚生物研究所Welsh等(1990)领导的两个小组同时发展起来的一种新的DNA指纹技术。

 

      此技术利用随机合成的寡聚核昔酸序列(9～10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，并经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱。在基因组上，每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段，对一个特定的基因型来讲，这些扩增的片段或片段的类型是唯一的，因此用来鉴定品种纯度是很有用的。

 

      傅家瑞(1994)曾报道：从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DNA片段;中国科学院遗传所陈洪等(1996)利用OPP—18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度，鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。

 

      RAPD技术反应灵敏、多态性强，操作简便，速度快，费用低，既有大量的随机引物可供筛选之用，又不受种属的限制，被广泛用于多种作物的种子鉴定。RAPD技术不足之处： 

 

      ①提供的信息不够全;

 

      ②结果重复性不好; 

 

      ③RAPD一般为显性标记，不能鉴定杂合子;

 

      ④提取种子DNA的方法仍较繁琐。因此，该项技术在种子纯度鉴定中存在有一定的局限性。

 

      3.微卫星技术 真核生物的基因组中散布大量的串联重复序列，其中，2～4个bp的微卫星序列(Micmsatellite或叫简单序列重复SSR：

 

      Simple5equenceRepeats)具有高度多态性(Taubll989，Tautz和Eenz，1984)，为DNA指纹分析提供了基础c微卫星在结构上的最大特点是两端序列较保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物进行PCE扩增，来揭示微卫星的多态性，从而减少了酶切、制备探针、分子杂交等繁琐程序。

 

      RusBell等(1997)发现在11个大麦SSR中，利用4个SSR组成的3个不同组合均可以区分24个大麦品种，错误概率仅为千分之一，来自相同亲本的不同基因型也可区分开。与传统形态学鉴定方法和其他品种鉴定技术相Lb，该技术多态性水平高(可用于亚种间鉴定，已在水稻的品种鉴定中得到应用)，易于分析，不受环境影响。但该技术程序复杂，费用较高，尽管在种子纯度检验上具有潜力，但目前尚不能普及。

 

      4.AFLP AFLP(Amplified Fragnent Len— gyhPo1ymorphism)扩增片段长度多态性是荷兰科学家Zabean等人(1993)发明的一项专利技术，实质是RFLP和PCR两项技术的结合，具有RFLP的稳定性和PCR技术的高效性。

 

      其原理如下：当基因组ONA经酶切后，会形成大小不等的随机限制性DNA片段，在这些限制性片段的两端连接上与酶切位点配对的特定接头，然后用与接头互补的专用引物进行PCR扩增、电泳、放射自显影显示DNA指纹。为有选择地扩增某些限制性片段，专用引物在酶切位点序列的3’端还添加1—10个长度不等的随机脱氧核苷酸，由此可调节AFLP产物条带的特异性和数量。

 

      该技术避免了分子杂交的复杂程序，灵敏度高、快速、多态性强、DNA的用量少、具较好的重复性。不足之处是操作时间长，步骤多，对实验技能及仪器设备的精密度要求很高，加之是专利技术，受专利法保护，所以该法不宜大面积普及推广。

 

      综上所述，作物种子纯度检验技术已由传统的形态学方法发展到分子水平，其方法是由简单到复杂，结果也更加精确。每一种方法都有其自身的优缺点，至今还没有哪一种方法能够比较准确、快速、经济地进行种子纯度检验。与其他方法相比，DNA分子标记技术多态性丰富、准确性高、重复性好、无器官发育时期的特异性，不受环境影响，但所需仪器精密、药品昂贵，程序复杂，离普及和应用尚有距离。

 

      因此，在进行具体的种子纯度检测时，应视具体情况灵活掌握，将传统的形态鉴定方法、现代生化方法和分子标记技术相结合，充分发挥综合技术优势，方能达到准确、经济、快速检测的目的。