育种家有话说 || 小麦遗传新种质的创制及遗传分析

      以下文章来源于一麦众承 ，作者倪永静

 

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      1创建小麦突变体库

 

      选用均匀一致的国麦301种子1kg，首先在冷水中浸泡4小时，然后用0.4%（v/v）EMS溶液在0℃处理种子2小时，接着在20℃处理14小时。排干EMS溶液，在流水中冲洗4个小时，晾干后种植于商丘市农林科学院双八试验基地。M₁代种子于2012年10月单粒播种，行距0.23m，株距0.08m，按单穗收获（即M₂种子）；M₂种子于2013年10月种穗行，行距0.23m，株距0.08m。M₁、M₂均以未处理的国麦301为对照。田间管理按一般试验田进行。

 

      每7~10d田间调查一次，观察记载幼苗、叶形、茎、分蘖、穗部、育性等性状，筛选各种表型突变体。变异穗系全部单株收获脱粒后，观察记载籽粒形状、大小、颜色等性状。

 

      对M₂ 12020个穗系的主要农艺性状及其他生物学性状进行调查，共获得769个突变体系。其中，5个苗期致死、109个株高突变、177个叶片性状突变（幼苗期、成株期）、82个穗部性状突变、18个成熟期发生突变，64个分蘖突变，45个不育突变，52个籽粒突变，217个其他性状的突变。M₂中发生表型突变的频率约为6.398%。具体突变类型如表1，部分突变体类型展示如图1。

 

 

 

图1部分突变体类型

 

      2 矮化独秆突变体dmc的生物学特征及遗传分析

 

      ▶2.1独秆突变体的获得及其生物学特征

 

      通过连续单株选择，获得了1个不分蘖突变体dmc纯合株系。该突变体完全不分蘖，只有一个主茎（图2-A），个别植株偶尔会有1个小分蘖。2016-2017年大田突变体株系dmc平均分蘖1.11个，突变亲本国麦301平均分蘖21.73个。突变体dmc植株明显矮小，株高48.00cm，是突变亲本国麦301的74.53%（图2-A）。进一步对比发现，突变体dmc只有4个节间，比国麦301少了一个节间，与突变亲本国麦301相比，突变体dmc各节间长度（倒Ⅰ-倒Ⅳ）均缩短（图2-F）；而且突变体dmc倒Ⅰ节间的直径比国麦301要小（图2-E）。

 

  图2 突变体dmc和国麦301主要农艺性状比较

      A: 抽穗期突变体dmc（右）与国麦301（左）植株对比，B: 突变体dmc（右）和国麦301（左）穗部对比，C: 灌浆期突变体dmc（右）和国麦301（左）籽粒对比，D: 蜡熟期突变体dmc（右）和国麦301（左）籽粒对比，E: 突变体dmc（下）和国麦301（上）倒1节间直径对比，F: 突变体dmc（右）和国麦301（左）节间对比。

 

      ▶2.2 遗传背景检测

 

      利用 SSR标记对突变亲本国麦301与突变体dmc的遗传背景进行检测比较，结果显示分布在42条染色体上的431个SSR标记扩增位点均没有发现差异性条带，表明突变亲本国麦301与dmc的遗传背景高度一致。这个结果证明突变体dmc是由国麦301诱变而来的。

 

 

M: 分子量标准（DL100）；泳道1-3：国麦301，泳道4-6：突变体dmc，扩增产物条带下是SSR引物名称

 

图3 SSR标记检测

 

      ▶2.3 国麦301和突变体dmc的组织学观察

 

      通过比较不分蘖突变体dmc和野生型对照国麦301的分蘖形态和显微结构，发现dmc中主茎基部的分蘖分化和发育都受到严重抑制（图4A-E）。在两叶期，dmc和国麦301在外部形态上几乎没有差异。组织学观察发现，国麦301的分蘖原基已经开始分化（图4F），但在dmc中未观察到分蘖原基（图4A）。在三叶期，国麦301的分蘖芽开始生长，在主茎基部形成两个一级分蘖（图4G），而在dmc基部仅形成一个微小的突起（图4B）。在四叶期，国麦301的主茎变长且增厚，分蘖原基增多（图4H，图5A）。同时期的dmc的主茎也伸长，可以观察到一个微小的分蘖原基在基部（图4C）。在越冬期，dmc平均株高（在自然状态下的最高离地高度）仅为12cm，是国麦301平均株高的一半（图5B）。组织学观察发现在dmc基部只有两个小分蘖原基（图4D），但国麦301处于分蘖旺盛期，分蘖数约为12-14个，分蘖主要由一级分蘖和二级分蘖组成（图4I）。在起身到拔节阶段，dmc的分蘖几乎与前期一样很小（图4E）。然而，国麦301的分蘖数已达到最大值（图4J, 图5C）。大多数dmc最终只有一个主茎（图5C）。

 

 

  （A、B、C、D、E：二叶期、三叶期、四叶期、越冬期和起身到拔节期之间的dmc；F、G、H、I：二叶期、三叶期、四叶期和越冬期的国麦301；J：起身到拔节期之间的国麦301的部分分蘖芽。MC：主茎；TP：分蘖原基；PT：一级分蘖；ST：二级分蘖。A-H，比例尺=1 mm；I和J，比例尺=1cm。）

 

      ▶2.4 国麦301和突变体dmc的组织化学观察

 

      在组织化学水平上，三叶期突变体dmc的分蘖原基与国麦301的分蘖原基有明显区别。dmc中通常只有一个小的分蘖突起，被染成淡黄紫色；相反，国麦301通常有两个分蘖芽，里面包裹着分蘖原基，被染成深黄色。这些表型说明国麦301的分蘖原基蛋白质含量明显高于dmc。此外，在国麦301的横切面上，有两个明显的黄色区域，即旺盛分蘖的原基部位。国麦301分蘖原基细胞排列整齐，胞质致密被染成深黄色，呈现典型的分生组织特征。然而，在dmc横切面中通常看不到分蘖原基及分生组织。总之，dmc分蘖原基少且分蘖原基蛋白质含量低于对照国麦301（如图4）。

 

      （A：dmc（箭头）分蘖的纵切面；B：国麦301（箭头）分蘖的纵切面；C：dmc分蘖基部的横切面；D：国麦301分蘖基部的横切面；E：C的放大图；F：D的放大图。TP：分蘖原基；TB：分蘖芽。
 

 

图5 三叶期的国麦301和dmc小麦分蘖中淀粉（紫色）和蛋白质（黄色）的分布

 

      ▶2.5 突变体dmc遗传学初步分析

 

      突变体dmc与中国春进行杂交，对F₁进行性状调查，结果发现F₁分蘖均减少，平均分蘖4.48个，而F₁株高介于两亲本之间。初步推测突变体dmc的独秆性状可能是由显性或半显性基因控制。

 

表2 突变体dmc、中国春及其F1代的株高和分蘖性

 

 

      3 小麦提前终止穗分化突变体ptsd1遗传调控机制研究

 

      ▶3.1突变体ptsd1表型分析

 

      突变体ptsd1的平均株高和穗长分别为50.75cm和4.19cm，与亲本国麦301相比分别降低了21.1%和缩短了60.0%。突变体ptsd1的平均可育小穗数和单穗籽粒数为4.50和14.16，与亲本国麦301相比分别减少了77.5%和77.9%。千粒重相比于亲本降低了19.8%。突变体ptsd1的抽穗期、开花期和成熟期分别推迟了9天、9天和11天。突变体ptsd1主要影响穗长和小穗数性状（图6）。

 

 

图6 对照国麦301和突变体ptsd1整株表型（A）和穗部表型（B）

 

      ▶3.2 突变体ptsd1幼穗分化的超微结构

 

      对照国麦301顶端小穗形成期幼穗超微结构显示（图8A），顶端分生组织（im）分化形成最后几个顶端小穗原基，上部小穗原基已经分化形成护颖原基、外稃原基和小花原基凸起，中部小穗中的小花原基已经分化形成三个雄蕊原基凸起（stp）和一个雌蕊原基凸起（pip）。突变体ptsd1只有约5个小穗原基正常分化（图8B），小穗中的小花原基分化形成三个雄蕊原基凸起（stp）和一个雌蕊原基凸起（pip），而上部小穗原基停止分化，最终形成一个个凸起状结构。经过越冬期，顶端分生组织逐渐从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡，顶端圆锥体迅速伸长（图7 A、A'）；在二棱期（图7 B、B'），对照国麦301和突变体ptsd1在都形成小穗脊（spr）结构；在二棱后期（图7 C、C'），对照的穗轴两侧小穗原基（spp）逐渐开始膨大，首先观察到中部小穗原基的膨大，然后向顶端和基部延伸，而突变体ptsd1的上部小穗原基停止分化，下部小穗原基逐渐开始膨大；在护颖原基形成期（图7 D、D'），对照护颖原基（glp）逐渐形成，大约形成12 ~ 14个小穗原基，而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基；在外稃原基形成期（图7E、E'），对照在护颖原基上方形成了外稃原基（lemp），大约形成14 ~ 16个小穗原基，而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在小花原基形成期（图7 F、F'），中部小穗的第一个小花原基（flp）分化形成，小花原基位于外稃原基上方，呈半球状，大约形成16 ~ 18个小穗原基，而突变体ptsd1只形成6 ~ 8个小穗原基，上部小穗原基仍停留在二棱期；在顶端小穗形成期（图7 G、G'），在这个时期对照除了最后几个顶端小穗原基分化外，不再形成新的小穗原基，而突变体ptsd1上部小穗原基仍停留在二棱期；在小穗原基分化结束后，对照小花原基逐渐开始分化最终形成雌蕊和雄蕊（图7H、I、J和K），突变体ptsd1下部小花原基正常分化形成雌蕊和雄蕊，而突变体ptsd1上部未分化的小穗原基没有分化形成小花原基及随后的雌雄蕊（图7 H'、I'、J'和K'）。在绿色花药时期，对照国麦301的上、中和下部小穗中均观察到正常的雌雄蕊形态（图7 L、M和N），而突变体ptsd1上部小穗原基未分化没有形成雌雄蕊（图7L'），突变体ptsd1的中部和下部小穗中均观察到正常的雌雄蕊形态（图7M'和N'）。观察记录穗发育时期发现，突变体ptsd1顶端圆锥体比囯麦301晚11天进入二棱期，且整个穗分化进程延迟了11天。

 

 图7 对照国麦301（A-N）和突变体ptsd1（A'-N'）的穗分化不同时期形态

 

      注：A：二棱初期，B：二棱期，C：二棱后期，D：护颖原基形成期，E：外稃原基形成期，F：小花原基形成期，G：顶端小穗形成期，H：雌雄蕊原基分化期，I：雌雄蕊原基分化末期，J：外稃完全包裹基部两个小花，K：绿色花药时期，L-N：绿色花药时期对照国麦301的上、中和下部雌雄蕊形态。A'-N': 突变体ptsd1与对照发育时期一一对应。spr，小穗脊；spp，小穗原基；spd，小穗分生组织的圆顶；glp，护颖原基；lemp，外稃原基；flp，小花原基；ts，顶部小穗；an，花药。红色括号标注的是从二棱期开始突变体ptsd1上部小穗原基不分化。小麦穗发育时期参考文献。

 

 

注：Im，花序分生组织；stp，雄蕊原基；pip，雌蕊原基

 

图8 对照国麦301（A）和突变体ptsd1（B）顶端小穗形成期幼穗超微结构

 

      ▶3.3 遗传分析

 

      突变体ptsd1与周麦18杂交组合，正反交F₁穗长正常（图9A-D），表明控制穗长性状位点为隐性基因。“ptsd1 × 周麦18”杂交F₂，穗长性状分离为三种表型，正常穗（NSL）、中等缩短穗（MSL）和极端缩短穗（ESL）。其中，正常穗的长度与亲本周麦18穗长相当，中等缩短穗的长度介于周麦18和突变体ptsd1之间，极端缩短穗的长度与突变体ptsd1相当。统计595个F₂单株穗长表型发现，正常穗、中等缩短穗和极端缩短穗分别为503、68和24个单株（表3）。假设穗长由一对隐性基因控制，统计正常穗和中等缩短穗（NSL和MSL）为571株，极端缩短穗（ESL）为92株，χ2检验结果显示χ2 ＞ P0.05，不符合孟德尔单基因遗传3:1的分离比，因此突变体ptsd1不是单基因隐性遗传。假设穗长由两对隐性基因控制，χ2检验结果显示χ2 ＞ P0.05，不符合15:1的分离比，因此突变体ptsd1也不符合孟德尔两对独立的隐性基因遗传。

 

 

      图9 对照国麦301（A）、突变体ptsd1（B）、周麦18（C）、ptsd1与周麦18正反交F₁（D）以及后代F₂或F2:3穗部形态（E-H）。

 

表3  F₂群体穗长性状遗传分析

 

 

      ▶3.4 结论

 

      周麦18和中国春分别与突变体ptsd1杂交，F₁穗型都正常，表明ptsd1控制穗长性状是由隐性基因控制的。在F₂和F2∶3群体中，正常和突变植株的分离比不符合经典孟德尔遗传学的1对隐性基因或2对独立分配、自由重组的隐性基因遗传的理论分离比。表明突变体ptsd1中，穗长性状不是由一对隐性基因也不是由两对独立遗传隐性基因控制。660K芯片SNP标记连锁分析和SSR标记连锁分析表明，在5A染色体的短臂和长臂上各有一个突变位点。因为这两个突变位点在同一条染色体上，存在基因连锁，所以遗传分离比不符合15:1。为此，ptsd1是首次发现的在5A染色体上同时存在两个基因控制穗分化的突变体。未来，我们将把这两个基因分解到不同的作图群体中，从而对每个基因进行图位克隆。

 

      基于目前的研究结果，构建了突变体ptsd1的遗传模型（图10）。将两对基因的四种基因型分别用A、a、B和b代替，如A：Ptsd1-5AS，a：ptsd1-5AS，B：Ptsd1-5AL和b：ptsd1-5AL。突变体ptsd1携带两对隐性基因aabb，正常穗长植株携带两对显性基因AABB，杂交F₁基因型为AaBb。F₁自交两代，在F2∶3筛选穗长分离的家系。根据F2∶4的分离情况，确定F2∶3家系单株是否纯合。筛选纯和的正常穗基因型AABB和极端缩短穗基因型aabb纯合株系构建BSA混池，本研究筛选获得的连锁标记都是基于这两个混池。

 

      将两个基因分解到两个遗传群体的方法有以下两种：

 

      1）筛选穗长性状分离的杂合F2∶3植株，根据连锁标记鉴定F2∶3中基因型为aaBb和Aabb的单株，自交一代得到F2∶4家系群体为一个基因纯合，另一个基因分离的遗传群体；

 

      2）筛选穗长性状不分离的纯合F2∶3植株，根据连锁标记鉴定F2∶3中基因型为aaBB和AAbb的单株，与突变体ptsd1回交一代得到基因型为aaBb和Aabb的单株，自交后获得单个基因的遗传群体。

 

 

图10 突变体ptsd1的遗传模型

 

      来源：一麦众承